Световая микроскопия

Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм, а электронные — для изучения более мелких объектов (вирусы и структуры микроорганизмов).

Световые микроскопы подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой (рис. 1.1-1.3). Отечественные микроскопы («Биолам», «Бимам», «Микмед») имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С — студенческие, Р — рабочие, Л — лабораторные, И — исследовательские); комплектация обозначается цифрой.

Рис. 1.1. Студенческий микроскоп

Рис. 1.2. Рабочий микроскоп

Рис. 1.3. Лабораторный микроскоп

Рис. 1.4. Принципиальная схема микроскопа и осветительной системы:
1 — источник света; 2 — коллектор; 3 — ирисовая полевая диафрагма; 4 — зеркало; 5 — ирисовая аппертурная диафрагма; 6 — конденсор; 7 — препарат; 7' — увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое объективом; 1" — увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в окуляре; 8 — объектив; 9 — выходной значок объектива; 10 — полевая диафрагма окуляра; 11 — окуляр; 12 — глаз.

В микроскопе различают механическую и оптическую части. К механической части относятся: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, а также встроеннье в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого (микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.
Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая, в свою очередь, состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также автономного или встроенного осветителя. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.
Основную роль в получении изображения играет объектив. Он «строит» увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, который, аналогично обычной лупе, дает увеличенное мнимое изображение.
Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет качества изображения. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей способностью микроскопа, т. е. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки. Предел разрешения — минимальное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно, — зависит от длины волны света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива. Числовая апертура, в свою очередь, зависит от угловой апертуры объектива и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом. Угловая апертура — это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше угловая апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между объективом и препаратом, к показателю преломления стекла, тем выше разрешающая способность объектива.
Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличенной в 500-1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным. В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают сухие объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90-100 х). Сухой объектив — это такой объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом находится воздух (рис. 1.5).
Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как у стекла (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива (рис. 1.6). В качестве иммерси
онной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии — кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются и оно, в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Нельзя пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом.

Рис. 1.5. Микроскопия без иммерсионной жидкости

Рис. 1.6. Микроскопия с иммерсионной жидкостью

Изображение, полученное с помощью линз, обладает различными недостатками: сферической и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др. В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки исправлены. В зависимости от степени исправления этих недостатков различают объективы ахроматы и более сложные — апохроматы. Соответственно, объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и планапохроматами. Использование этих объективов позволяет получить резкое изображение по всему полю, тогда как изображение, полученное с помощью обычных объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения. Характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива (АПО — апохромат и т. п.); объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объективы масляной иммерсии — обозначение МИ и черное кольцо. Объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17 мм. Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (40 х). При работе с иммерсионными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм, потому что толщина покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может повреждаться фронтальная линза объектива.
Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя недостатки изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.
Конденсор предназначен для фокусирования на препарате света от осветителя, направляемого зеркалом микроскопа или осветителя (в случае использования накладного или встроенного осветителя). В конденсоре имеется апертурная диафрагма, необходимая для правильного освещения препарата.
Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания, трансформатора, коллекторной линзы и полевой диафрагмы, от раскрытия которой зависит диаметр освещенного поля на препарате. Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необходимо использовать только плоскую сторону зеркала.
Настройка освещения и фокусировка микроскопа. Качество изображения в значительной мере зависит от правильного освещения. Наиболее распространенным способом освещения препарата является установка света по Кёлеру.

Этапы установки света по Кёлеру.
1)   Устанавливают осветитель против зеркала микроскопа.
2)   Включают лампу осветителя и направляют свет на плоское (!) зеркало микроскопа.
3)   Помещают препарат на предметный столик микроскопа.
4)   Закрывают зеркало микроскопа листом белой бумаги и фокусируют на нем изображение нити лампы, передвигая патрон лампы в осветителе.
5)   Убирают лист бумаги с зеркала.
6)   Закрывают апертурную диафрагму конденсора. Перемещая зеркало и слегка передвигая патрон лампы, фокусируют изображение нити на апертурной диафрагме. Расстояние осветителя от микроскопа должно быть таким, чтобы изображение нити лампы было равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора (наблюдать апертурную диафрагму можно с помощью плоского зеркала, помещенного с правой стороны основания микроскопа).
7)   Открывают апертурную диафрагму конденсора, уменьшают отверстие полевой диафрагмы осветителя и значительно уменьшают накал лампы.
8)   При малом увеличении (10 х), глядя в окуляр, получают резкое изображение препарата.
9)   Слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафрагмы, которое имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор, добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы в плоскости препарата (вокруг них может быть видна цветная каемка).
10) Раскрывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения, увеличивают накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы конденсора.
11) При смене объектива необходимо проверить настройку света. После окончания настройки света по Кёлеру нельзя изменять положение конденсора, раскрытие полевой и апертурной диафрагмы. Освещенность препарата можно регулировать только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата. Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному снижению контрастности изображения, а недостаточное — к значительному ухудшению качества изображения (появлению дифракционных колец). Для проверки правильности раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус, открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на 1/3. Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения (до 10 х) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.

Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение — с сильными сухими (40 х) и иммерсионными (90 х) системами, чтобы не повредить фронтальную линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбоку, опускают объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом, затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.
При работе с микроскопом нельзя прилагать большие усилия. Нельзя касаться пальцами поверхности линз, зеркал и светофильтров. Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов и призмы тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе. При чистке внешних поверхностей линз следует удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чистым бензином, петролейным эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется протирать оптику объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию. С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее резиновой грушей. Протирать их нельзя. Нельзя также самостоятельно развинчивать и разбирать объективы — это приведет к их порче. По окончании работы на микроскопе необходимо тщательно удалить остатки иммерсионного масла с фронтальной линзы объектива указанным выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом. Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать его мягкой тряпкой, слегка пропитанной бескислотным вазелином, и затем сухой мягкой чистой тряпкой.